锐谈 | Bioresour. Technol.：代谢工程改造解脂耶氏酵母高效生产虎杖苷

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分类：新闻动态
作者：尤
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发布时间：2023-10-31 14:40
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虎杖苷又称白藜芦醇苷，是植物虎杖的提取物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、神经保护、心脏保护和免疫调节等作用。虎杖苷是白藜芦醇的糖基化衍生物，较白藜芦醇有更高的水溶性、稳定性和抗氧化能力。

2023年5月，华东理工大学叶邦策教授团队在Bioresource Technology上发表了题为“Metabolic engineering for the high-yield production of polydatin in Yarrowia lipolytica” 的研究论文。该研究团队以解脂耶氏酵母为生产宿主，葡萄糖为碳源，通过增加前体的供应、改变碳代谢、消除产品降解途径以及优化培养基中的葡萄糖浓度的组合策略，实现虎杖苷高产，产量达6.88 g/L。

主要研究内容：

1. 在解脂耶氏酵母中构建白藜芦醇的合成途径

首先，在解脂耶氏酵母中建立虎杖苷的前体白藜芦醇的合成途径。通过在基因组中整合酪氨酸解氨酶（TAL）、4-香豆酰辅酶 A 合成酶（4CL）和白藜芦醇合成酶（ST1），使得白藜芦醇产量为100.8 mg/L。

2. 增加莽草酸途径通量和直接碳流以合成白藜芦醇

为了进一步提高白藜芦醇的产量，研究人员尝试增加莽草酸途径通量以提高前体酪氨酸合成。通过在基因组中的MHY1位点引入来自大肠杆菌的抗反馈抑制的两个酶 AroG*和TyrA *，成功地增加了莽草酸途径通量，改造后的菌株可产生146.26 mg/L的白藜芦醇和315.16 mg/L的对香豆酸。

3. 增加ST1拷贝数以提高白藜芦醇产量

上述结果表明，虽然对莽草酸途径进行修饰可以提高白藜芦醇的产量，但仍有许多对香豆酸不能有效地转化为白藜芦醇，推测可能是白藜芦醇异源合成途径活性有限导致的，因为对香豆酸转化为白藜芦醇主要需要4CL和ST1的催化作用，因此分别增加了4CL和ST1的拷贝数，发现当添加两个ST1拷贝时，白藜芦醇产量提高了174%，说明了ST1过表达可以有效地将合成途径转向白藜芦醇的合成。

4. 将碳重新分配到前体以提高白藜芦醇产量

PHK途径由磷酸酮醇酶(PK)和磷酸转乙酰酶(PTA)组成，PK可将F6P分解为E4P和Ac-P，而PTA可将Ac-P转化为乙酰辅酶A，因此PHK途径的引入不仅增加了E4P的可用性，而且增加了前体乙酰辅酶A的供应。所以研究人员引入来源于双歧杆菌的PK和枯草芽孢杆菌的PTA，最终使白藜芦醇产量达到 487.77 mg/L。

5. 在解脂耶氏酵母中从头合成虎杖苷

白藜芦醇的糖基化可产生虎杖苷，研究人员便将白藜芦醇3-O-糖基转移酶R3GAT导入菌株Yar5的DGA1位点中，实现了虎杖苷的生物合成。

6. 通过敲除葡萄糖苷酶以抑制虎杖苷的水解

然而，在合成虎杖苷时，在发酵后期观察到了虎杖苷的降解和白藜芦醇的积累，降解现象可能源于解脂耶氏酵母中存在的葡萄糖苷酶。因此，研究人员筛选并鉴定了来自解脂耶氏酵母内源的葡萄糖苷酶，最终确定同时敲除EXG1和BGL2可有效抑制虎杖苷降解。由于白藜芦醇苷是糖苷类化合物，葡萄糖同时作为碳源和糖基配体，需要优化葡萄糖浓度以进一步提高产量，在YPD（100 g/L）培养基中发酵144小时后，虎杖苷的产量为6.88 g/L。