锐谈 | Nat. Commun.：通过游离脂肪酸操纵细胞膜改善植物多酚的微生物合成

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分类：新闻动态
作者：Sleepingman
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发布时间：2023-10-31 14:49
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植物多酚具有重要的营养和药用价值。然而，大多数多酚对微生物具有细胞毒性，它们会对细胞的完整性以及物质的运输过程产生负面影响。为了提高工程菌株的生产性能，必须制定策略来缓解这些有害影响。

白藜芦醇作为植物多酚的一种，来自德国亚琛工业大学的Jan Marienhagen教授和他所带领的团队利用谷氨酸棒杆菌研究了白藜芦醇生产过程中产物在细胞膜和细胞壁中的积累情况，通过实验和分子动力学模拟揭示了由白藜芦醇导致的膜硬化效应。通过筛选游离脂肪酸最终使白藜芦醇滴度提高了三倍。

白藜芦醇在谷氨酸棒杆菌中的定位

谷氨酸棒杆菌RES1是一种白藜芦醇生产菌，研究发现RES1 的细胞质（0.72 ± 0.01 mM）、细胞膜和细胞壁（1.2 ± 0.03 mM）中的白藜芦醇含量分别相当于总产物浓度的 30% 和 58%（图1）。这表明白藜芦醇主要富集在细胞膜。

筛选可降低白藜芦醇细胞毒性的脂肪酸补充剂

RES1 的培养基中单独补充 12 种不同的脂肪酸，以改善白藜芦醇的跨膜外流。实验中包含的脂肪酸有：4 种饱和脂肪酸、6 种顺式不饱和脂肪酸、2 种反式不饱和脂肪酸。发酵结果显示棕榈酸和亚油酸对应的白藜芦醇滴度最高（图2b, c）。

补充棕榈酸或亚油酸可改善白藜芦醇的合成

添加不同浓度的棕榈酸和亚油酸，研究提高白藜芦醇产量的最佳脂肪酸浓度。结果显示加入40 µM的亚油酸，产量提升了50%（1.75 ± 0.01 mM）并对生长产生抑制。棕榈酸则没有表现出过强的抑制生长的负面影响，最高产量为1.94 ± 0.03 mM。当加入20 µM棕榈酸和20 µM亚油酸混合物时，白藜芦醇的最终产量为1.8 mM。

白藜芦醇对膜结构和特性的影响

通过劳丹荧光测定法（Laurdan fluorescence assays）研究了在产生白藜芦醇的过程中膜流动性的变化，劳丹荧光极化（GP）值为衡量膜流动性的参考。诱导后GP增加表明白藜芦醇会导致细胞膜硬化（图3a）。添加有0.5 mM白藜芦醇的细胞荧光结果表明白藜芦醇的存在会立刻对细胞膜产生硬化作用（图3b）。为了从分子水平解释荧光测量得出的 GP 值增加的原因，Jan Marienhagen团队使用粗粒马蒂尼力场（coarse-grain Martini forcefield）对谷氨酸棒杆菌细胞膜模型进行了 MD 模拟。在模拟过程中，作者观察到白藜芦醇分子以极低的概率从膜上脱离，随后在水中停留一段时间后再重新结合。MD 模拟显示膜侧向压缩系数增加了两倍以及主要脂质的扩散系数减慢了约两倍表明白藜芦醇显著增加了脂膜的刚性，同时减缓了其动态变化（图4e）。

补充脂肪酸可抵消白藜芦醇的作用

在有棕榈酸和亚油酸存在的情况下，对RES1 产生白藜芦醇过程中膜流动性进行分析。结合HPLC-MS检测得到的游离的棕榈酸和亚油酸结果表明，补加的棕榈酸和亚油酸主要以游离的形式存在于细胞膜中。

补充多种脂肪酸可增加白藜芦醇的合成

由于高浓度的亚油酸会对RES1 的生长和白藜芦醇生产产生负面影响，因此在培养过程中，于0 h、24 h、48 h添加了三次 40 µM 亚油酸或 40 µM 棕榈酸，结果显示脉冲流加分别将产量提高了17% 和21%（图5）。此外，Jan Marienhagen团队还研究了生产黄酮类化合物柚皮苷的重组菌NAR1能否借助脂肪酸提升产量。结果显示（0 h、24 h、48 h）多次补充 40 µM 亚油酸或棕榈酸可使柚皮苷滴度增加两倍（图5c, d）。