锐谈 | Metab. Eng.:IPP旁路甲戊酸途径生产异戊烯醇的高通量酶筛选平台
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- 发布时间:2023-12-01 13:49
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异戊烯醇是生物燃料中的一种,异戊二烯等商品化学品的前体。
目前已知在大肠杆菌中通过甲羟戊酸途径(MVA)和磷酸甲基赤藓糖醇(MEP)途径生产异戊烯醇,产量为理论最大值的70%。
本文基于甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)的混杂活性开发基于IPP旁路的异戊烯醇途径。
一分子MVA由两步磷酸化转变为一分子MVAPP,消耗两分子ATP,再经过脱羧酶PMD生成一分子IPP,消耗一分子ATP,图(A)。
综上通过MVA途径生产1分子IPP需要消耗3分子ATP,同时IPP水解时磷酸基团又会被浪费,同时IPP积累会抑制大肠杆菌生长。
MVA途径由于异戊烯基二磷酸(IPP)的毒性,及ATP的高需求量,难以再次提高产率。
二.IPP旁路途径
文章改进:本文改用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)的混杂活性开发基于IPP旁路的异戊烯醇途径。
选择异源表达酿酒酵母PMD酶(PMDsc)脱羧MVAP形成磷酸异戊烯基(IP),此途径可以降低IPP毒性,并降低ATP的消耗,图(B)。
将宿主菌株生长速率与PMD酶脱羧速率耦合,筛选PMD突变体。
方案:
1. 在培养基中添加MEP途径抑制剂Fosmidomycin(磷霉素),抑制MEP途径,阻断产生IPP和MAPP的唯一途径,图(B)。
2. 将PMDsc的混杂酶活性,与IPP、二甲基焦磷酸烯丙酯DMAPP(大肠杆菌生长的必需代谢产物)的形成相耦合。
3. 补充抑制MEP途径的抗生素消除内源性MEP途径产生的IPP,只有异源IPP旁路的表达大肠杆菌才能生长。
对比报道中三种对IP有活性的激酶EcIPK、MtIPK、TaIPK在DH1菌株野生型中表达,对比得出MtIPK活性最高。
对三种PMDsc突变体(K22M、R74H、S208E)的动力学测定,R74H突变体活性最好,同时生长速率也最快。
四.筛选平台的应用
作者:祭