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锐谈 | Metab. Eng.:IPP旁路甲戊酸途径生产异戊烯醇的高通量酶筛选平台

锐谈 | Metab. Eng.:IPP旁路甲戊酸途径生产异戊烯醇的高通量酶筛选平台

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  • 来源:
  • 发布时间:2023-12-01 13:49
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锐谈 | Metab. Eng.:IPP旁路甲戊酸途径生产异戊烯醇的高通量酶筛选平台

【概要描述】

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异戊烯醇是生物燃料中的一种,异戊二烯等商品化学品的前体。

目前已知在大肠杆菌中通过甲羟戊酸途径(MVA)和磷酸甲基赤藓糖醇(MEP)途径生产异戊烯醇,产量为理论最大值的70%。

本文基于甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)的混杂活性开发基于IPP旁路的异戊烯醇途径。

一.MVA途径及不足

一分子MVA由两步磷酸化转变为一分子MVAPP,消耗两分子ATP,再经过脱羧酶PMD生成一分子IPP,消耗一分子ATP,图(A)。

综上通过MVA途径生产1分子IPP需要消耗3分子ATP,同时IPP水解时磷酸基团又会被浪费,同时IPP积累会抑制大肠杆菌生长。

MVA途径由于异戊烯基二磷酸(IPP)的毒性,及ATP的高需求量,难以再次提高产率。

二.IPP旁路途径

文章改进:本文改用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)的混杂活性开发基于IPP旁路的异戊烯醇途径。

选择异源表达酿酒酵母PMD酶(PMDsc)脱羧MVAP形成磷酸异戊烯基(IP),此途径可以降低IPP毒性,并降低ATP的消耗,图(B)。

同时PMDsc对非天然底物MVAP的活性相对较低,因此需构建PMD的突变菌株,提高活性。
三.构建筛选平台

将宿主菌株生长速率与PMD酶脱羧速率耦合,筛选PMD突变体。

方案:

1. 在培养基中添加MEP途径抑制剂Fosmidomycin(磷霉素),抑制MEP途径,阻断产生IPP和MAPP的唯一途径,图(B)。

2. 将PMDsc的混杂酶活性,与IPP、二甲基焦磷酸烯丙酯DMAPP(大肠杆菌生长的必需代谢产物)的形成相耦合。

3. 补充抑制MEP途径的抗生素消除内源性MEP途径产生的IPP,只有异源IPP旁路的表达大肠杆菌才能生长。

步骤1:

对比报道中三种对IP有活性的激酶EcIPK、MtIPK、TaIPK在DH1菌株野生型中表达,对比得出MtIPK活性最高。

结论:优化了大肠杆菌DH1只能从由MVA途径旁路途径中产生的IPP中存活,验证了细胞生长仅依赖于异源表达的IPP旁路中MVAP的脱羧反应。
(图a)
步骤2:

对三种PMDsc突变体(K22M、R74H、S208E)的动力学测定,R74H突变体活性最好,同时生长速率也最快。

结论:生长速率根据MVAP脱羧活性和PMDsc的表达水平而变化。
(图b)

四.筛选平台的应用

构建好整个筛选平台的底层菌株后,对PMDsc构建酶文库,验证多种不同的PMDsc突变体在构建好的筛选平台条件(即表达MtIPK的DH1菌株,在含磷霉素的培养基中培养)下酶活性、菌株生长速率与产物滴度具有一定的关联性,(表2)。
原文链接:https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.03.010

作者:祭

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