锐谈 | Biotechnol.：利用蛋白质工程、辅因子工程、表面展示技术实现硫酸软骨素A的全细胞催化生产

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发布时间：2023-12-01 11:18
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硫酸软骨素A(CSA)是一种有价值的糖胺聚糖，具有巨大的市场需求。然而，目前的合成方法因需要昂贵的硫酸基供体PAPS和低效的酶碳水化合物磺基转移酶11(CHST11)而受到限制。江南大学的刘立明团队在Biotechnology and Bioengineering 上发表了题为“Protein engineering, cofactor engineering, and surface display engineering to achieve whole-cell catalytic production of chondroitin sulfate A”的研究，他们在E.coli中构建了CSA的全细胞催化合成途径。利用基于机制的蛋白质工程，提高了人源CHST11的热稳定性和催化效率；其Tm和半衰期分别增加了6.9 °C和3.5 h，比活性增加了2.1倍。通过辅因子工程，设计了再生 ATP 和 PAPS 的双循环策略，以增加 PAPS 的供应。通过表面展示技术，实现了CHST11的外膜表达，构建了CSA生产的全细胞催化体系，转化率达到89.5%。

1.CSA体外合成级联途径的构建

通过文献挖掘，选择来自乳酸克鲁维酵母的KlATPS和来自产黄青霉菌的PcAPSK构建PAPS合成途径。此外，还筛选了8种不同来源的磺基转移酶（CHST11）。考虑到可溶性CHST11的表达量较低，使用带有融合标签TrxA的pET32a(+)载体来提高表达水平和使用分子伴侣的同时，还在N端截短了60个氨基酸，TF的添加使酶活性显着提高了5倍。

为了在体外验证设计级联的可行性，将纯化的酶与 60 mM ATP、100 mM Na2SO4和10 g/L软骨素一起孵育生成CSA，酶转化率为38.8%。分别测量了三种酶的比活性和转化率，PAPS的转化率为45.5%，而CSA的转化率为42.3%。因此，HsCHST11是该途径中的限速酶。

2. 蛋白质工程提高HsCHST11的热稳定性

37℃孵育8小时后，HsCHST11的酶活性降低近一半，其Tm值约为61.6℃。基于 HsCHST11 的预测结构，使用 PROSS和Consensus Finder 数据库进行序列比对，通过对给出的突变体进行热稳定性的测定，突变体直接组合得到M6(M2+M5)，半衰期为11.5 h，Tm值比野生型高68.5℃、3.5 h和6.9℃。

3. 蛋白质工程提高HsCHST11活性

为了提高HsCHST11的活性，基于预测的HsCHST11的结构和典型硫转移酶的反应机理，提出了HsCHST11类似SN2的催化机制。磺酰基转移反应、PAPS的进入和副产物PAP的释放也可能是整个过程中的限速步骤，这已在肝素6-O-磺酰基转移酶(6-OST)中观察到。虽然HsCHST11与肝素6-OST序列同源性小于20%，但这两种酶在其核心折叠区都具有门环结构，可以控制PAP(S)的进入和释放。作者对apo-HsCHST11和HsCHST11-PAPS二元配合物进行了50 ns MD模拟，结果发现门环的开启和关闭主要是通过残留物之间的静电相互作用来实现的。因此，优化“打开”和“关闭”过程可以控制PAP(S)的结合和释放，从而提高酶的活性。

根据门环的开启和关闭机制，筛选位于门环入口的残基作为候选突变位点，排除保守残基。从耐热突变体M6开始，采用两种策略优化门环的性能：(1)减小N130、N198、K300、Y304、E313和E317的体积，从而增大门环的体积，降低对PAPS的阻塞效应；(2)用柔性残基Ser、Gly和Ala(不包括A305)替代残留L299、T303、A305、T308、T310、T315和T316，有望提高门环的灵活性，从而加速PAP(S)的进入和释放。突变体实验数据表明，加宽门环可能会加速PAPS的进入，增加门环的柔韧性可能会降低门环打开和关闭所需的能量，从而提高酶的活性。

4. 增加 PAPS 供应的辅因子工程

通过蛋白质工程设计的最佳突变体HsCHST11 M12被导入到构建好的体外通路中。因此，预计通过辅因子工程可以增加PAPS的供应，从而进一步改善CSA的合成。为了回收ADP，构建了由E.coli焦磷酸酶EcPPA和球形红细菌多磷酸激酶RsPPK组成的ATP再生系统。随后，引入来自褐家鼠的芳基磺基转移酶RnASTIV使PAPS再生，可以使用pNPS 作为磺酰基供体对其进行磺化。通过将ATP再生和PAPS循环系统引入初始级联途径，CSA体外转化率达到82.7%，表明这两个系统可能具有相加特性。

5. 全细胞催化合成CSA的表面显示工程

将上述六种酶在E.coli中共表达。构建的N端含有冰核蛋白的HsCHST11 M12融合蛋白表面展示系统，INPN-HsCHST11 M12-EGFP用pET22b(+)载体表达，成功将HsCHST11 M12锚定在E.coli外膜上。

工程菌株P1仅显示出38.3%的软骨素硫酸化活性，这可能是由于E.coli有限的细胞表面积无法充分展示表达的蛋白质。因此，将诱导时间从16 h延长至24 h，将催化水平提高至79.8%。为了进一步提高转化率，还优化了表面活性剂的浓度，并添加了碱性蛋白、还原剂和可以激活HsCHST11 M12的金属离子。最终，CSA与10 g/L软骨素底物的转化率为89.5% 。