锐谈 | Green Chem.：地衣芽孢杆菌系统代谢工程高产抗氧化剂羟基酪醇

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分类：新闻动态
作者：柏树
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发布时间：2023-11-16 16:05
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羟基酪醇（HT）是一种多功能多酚，是一种强效的天然抗氧化剂。HT可以清除自由基以减少细胞的氧化，还具有抗癌、抗炎和抗微生物活性。羟基酪醇作为一种功能成分在化妆品、食品、，和营养品行业，并显示出强大的市场价值。

2023年10月，湖北大学陈守文教授团队在Green Chemistry上发表了题为“Systematic metabolic engineering of Bacillus licheniformis for hyperproduction of the antioxidant hydroxytyrosol”的研究论文。该团队以地衣芽孢杆菌为生产宿主，通过蛋白质工程、途径优化、辅因子工程和补料分批发酵，以葡萄糖为碳源从头合成羟基酪醇（HT），产量达9475 mg /L。

1.建立HT生物合成的人工途径

首先，在地衣芽孢杆菌建立羟基酪醇（HT）合成途径。通过大肠杆菌的HpaB和HpaC基因导入、Ehrlich途径引入、KivD蛋白质工程，从酪氨酸开始，产生113±14 mg /L的HT，从葡萄糖开始，产生21±4 mg/ L的HT。

2.增强莽草酸途径并阻断竞争途径以提高HT产量

为了将更多的碳通量引导至HT生产，进行了增强PEP供应、消除反馈抑制/抑制和阻断竞争途径的研究。经过aroK的过表达、删除pheA和hisC，删除dhbC和dhaS， HT达到2078±121 mg /L。

3.鉴别和敲除酪醇降解途径

向培养基中加入2 g/L酪醇时，DWc9n/pHY300菌株消耗110 mg/L酪醇，表明地衣芽孢杆菌可能具有酪醇降解途径。经过14种脱氢酶筛选，证明adhA在酪醇降解途径中起着至关重要的作用，后续adhA敲除，HT滴度增加到2202±133 mg/L，没有酪醇积累。

4.调节糖运输系统以增加HT生产的碳通量

提高关键基因转录水平分，glcU、glcK和ptsG分别是DHT1菌株的18.8、47.4和0.22倍。改变糖转运系统降低了溢出代谢，HT产量最高3299±150 mg/L。

5. KivDVI和HpaBC表达水平的微调

经过不同强度的启动子调节基因kivDVI、hpaB和hpaC的表达水平，HT产量最高4650 ±229mg/L。

6. 菌株中新限速步骤的识别、消除、5L发酵

向培养基中加入0.5 g/L的4-HPP时，HT滴度增加；而当添加0.5 g L−1莽草酸时，HT效价略有下降，合成4-HPP可能是DHT17中的限速步骤。TyrAM53I/A354V的额外拷贝被进一步整合到DHT17中以增强TyrAfbr的表达, 菌株DHT21产生5908±268 mg/L的HT。其后增强E4P的供应， PP途径的关键基因（zwf和tkt）过表达，菌株DHT23产生6299±271 mg/L的HT。菌株DHT23在5L发酵罐中进行补料分批，24小时后产生的HT量达到9475 mg/L。