锐谈 | Bioresour. Technol：利用谷棒自动调节胞内的NADPH来改善L-赖氨酸的生产

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分类：新闻动态
作者：cTiyAmo
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发布时间：2023-11-16 16:04
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L-赖氨酸作为必须氨基酸之一，被广泛应用于饲料、医药和食品工业中。谷氨酸棒状杆菌作为L-赖氨酸的高产菌，在碳通量方面的工程改造已经有较多研究，然而NADPH和ATP作为细胞环境的重要组成部分和L-赖氨酸生物合成的重要辅助因子而报道较少。

江南大学张卫国团队构建了一个对细胞内赖氨酸浓度敏感的启动子文库，并应用于NADP依赖的甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达，实现了NADPH的动态调控，后经过发酵，工程菌株的赖氨酸产量可达到223.4 g/L左右。

1、代谢通量调节与ATP供应

作者对前期构建的赖氨酸生产菌株进行了基因组测序，鉴定了与赖氨酸合成相关的天冬氨酸激酶（lysC）、二氢吡啶二羧酸合酶（dapA）、N-琥珀酰二氨基二聚脱琥珀酰酶（dapD）、二氨基苯甲酸酯聚酶（dapE）4个关键酶基因的突变。随后在此基础上，进行pck敲除，pyc、ppc过表达，增加赖氨酸前体，重新分配碳通量，将赖氨酸相关路径上的全部基因启动子替换成强启动子Ptrc，提高相关酶活，并阻断相关的竞争性路径，包括乳酸途径、L-丙氨酸途径、高丝氨酸脱氢酶突变，将碳通量定位至赖氨酸合成路径中，形成菌株lys4，经过发酵，赖氨酸产量由45.8 g/L提升至62.49 g/L。进一步地，菌株中pgk、pyk基因启动子替换成强启动子，并敲除amn基因，增加赖氨酸合成必须的ATP供应，构建菌株lys4.3/△amn产量达到69 g/L。

2、赖氨酸转运系统测试

促进产物流出或防止再摄取来控制细胞内L-赖氨酸浓度防止反馈抑制。作者先是敲除了赖氨酸转入系统LysP，发现对赖氨酸产量无明显影响，随后增强了赖氨酸转出系统lysE，产量仍然没有什么变化，进一步地，作者过表达了来源于大肠的赖氨酸转运系统ybjE，赖氨酸产量无明显变化，这一数据说明工程菌株体内的赖氨酸转运系统已经足够L-赖氨酸的转运。

3、赖氨酸响应启动子库的建立

转录调节因子LysG可以感知细胞内L-赖氨酸的含量，而lysE启动子（PlysE）可以在其调控下刺激靶基因的表达。作者首先敲掉了菌株体内天然存在的lysG，随后引入了对赖氨酸响应的突变基因LysG，启动子为PlysE，发现该启动子强度为Ptrc启动子的一半，为了以L-赖氨酸响应的方式精确动态地调节多个基因的表达，对PlysE启动子进行了修饰，以满足代谢调节的响应效应。作者对PlysE的13个碱基进行了任意突变，得到了强度不同的30个启动子，其中，PlysE-7和Ptrc启动子强度基本一致，并将这30个启动子进行强度划分，随后，用不同强度的启动子对pntAB和gapN基因进行表达，来实现NADPH的动态调控，结果发现，随着启动子的增强，NADPH的含量提高，赖氨酸的产量也在提高，作者最终选择了PlysE-28号启动子取实现gapN的动态调控，经过发酵，赖氨酸的个能够达到80 g/L左右，通过补料分批，赖氨酸产量为223.4 g/L左右。